Preiskave likvorja

Lumbalna punkcija in sodobna likvorska diagnostika pri multipli sklerozi

Likvor je brezbarvna tekočina, ki je prisotna v možganskih votlinah – ventriklih in obliva možgane in hrbtenjačo. Nastaja v skupkih žilja in celic imenovanih horoidni pletež v stenah stranskih, tretjega in četrtega ventrikla. Vsako minuto nastane približno 0,3 ml likvorja, ki se stalno obnavlja in kroži. Iz stranskih možganskih ventriklov najprej priteče v tretji ventrikel in se nato preko možganskega vodovoda - akvedukta spusti v četrti ventrikel. Skozi posebne odprtine na bazi prehaja v subarahnoidni prostor (prostor med možganskima ovojnicama pio in arahnoideo). Kroženje v subarahnoidnem prostoru nadaljuje navzdol proti hrbtenjači ali navzgor proti poloblam možganov. Skozi izrastke venskih sinusov, Pacchionijeve granulacije, se likvor vrne (resorbira) v vensko kri. Celotna količina likvorja v možganskih ventriklih in subarahnoidnih prostorih je 100-150 mL, dnevno pa ga nastane približno 500 mL, kar pomeni, da se obnovi 3-5-krat na dan.
Likvor je medij v katerem krožijo celice, beljakovine in nekateri hormoni. Možgane mehansko varuje pred poškodbo, omogoča vzdrževanje elektrolitskega ravnovesja in stalnega pH osrednjega živčevja. Preiskave likvorja so pomembne v diagnostični obravnavi številnih bolezni osrednjega živčevja, saj lahko z njimi potrdimo vnetni proces, ugotovimo krvavitve v likvorski prostor ali poškodbo možganskega tkiva.

Postopek lumbalne punkcije

Pregled likvorja z lumbalno punkcijo, ki jo je prvi opisal Quincke leta 1891, je eden od osnovnih diagnostičnih postopkov v nevrologiji. Likvor je bistra, brezbarvna tekočina, v kateri je približno enaka koncentracija elektrolitov kot v krvi in nekoliko nižja koncentracija glukoze. Normalna koncentracija beljakovin v likvorju je 0,15-0,45 mg/L, številčna koncentracija levkocitov pa do 5·10^6/L. Pri lumbalni punkciji v ležečem položaju izteka likvor pod tlakom 80-180 mm H2O.
Lumbalna punkcija je invaziven poseg. V glavnem je sicer neboleča in v veliki večini primerov nenevarna preiskava, ki pa se je bolniki bojijo. Ključen del priprave na poseg so zato ustrezna navodila in pogovor z bolnikom pred preiskavo. Za uspešno in malo bolečo punkcijo je pomemben pravilen položaj bolnika pri posegu. Običajno leži na trdni površini v bočnem položaju s pokrčenimi koleni, tako da je ravnina hrbta pravokotno na podlago ležišča. Nevrolog s tanko iglo z manšeto zbode med 3. in 4. ledvenim vretencem (višina roba medenice) pravokotno na površino hrbta in jo usmeri proti glavi. Pri počasnem prodiranju igle v globino pogosto zazna predrtje dure, ki je zunanja možganska ovojnica.  Z odstranitvijo manšete preveri, če je v subarahnoidnem prostoru in najprej izmeri likvorski tlak, nato pa odvzame približno 10 mL cerebrospinalne tekočine za preiskave.

Postopek lumbalne punkcije je relativno varen, ni pa povsem brez tveganj. Zapleti so običajno blagi. Najpogostejši zaplet je post-punkcijski glavobol, ki ga opisuje nekaj manj kot 30 % bolnikov. Značilnost glavobola je, da se pojavi v stoječem položaju, najbolj pogosto je prisoten v zatilju in traja nekaj dni. Glavobol se verjetno pojavi zaradi pronicanja likvorja skozi možganske ovojnice na mestu vboda. Ob odtegnitvi likvorja lahko možgani »nasedejo« na možganske ovojnice, vlek in raztezanje možganskih ovojnic, ki sta izrazitejša v pokončnem položaju, pa občutimo kot glavobol. Terapija post-punkcijskega glavobola vključuje  mirovanje, nadomeščanje tekočine in analgetike.

Redkejši zapleti po lumbalni punkciji so dolgotrajna bolečina na mestu vboda, vztrajno mravljinčenje in otrplost v nogah, okvare možganskih živcev. Epiduralna krvavitev po punkciji je opisana pri bolnikih z motnjami strjevanja krvi. Lokalne okužbe so celo pri bolnikih s sepso izjemno redke.

Preiskave likvorja pri multipli sklerozi (MS)

Enostavne preiskave, s katero bi zanesljivo potrdili diagnozo MS nimamo, zato si pomagamo z diagnostičnimi merili. Princip diagnostičnih meril temelji na dokazu razsejanosti bolezni v času in prostoru osrednjega živčevja. Poleg tipičnega kliničnega poteka z zagoni in izboljšanji nevroloških simptomov, si pomagamo tudi s parakliničnimi preiskavami, kot so magnetnoresonančno slikanje (MRI), izvabljeni odzivi in analiza likvorja. MRI glave prikaže značilne spremembe v beli možganovini pri bolnikih z MS, s čimer dokažemo razsoj bolezni v prostoru.  Obarvanje posameznih lezij z gadolinijevim kontrastnim sredstvom (večina lezij se ponavadi ne obarva) nam služi za dokaz razsejanosti sprememb v času. Razsejanost v prostoru lahko dokažemo tudi z elektrofiziološko diagnostiko – izvabljenimi odzivi.

Pregled likvorja ima dodatno diagnostično vrednost pri sumu na MS, saj razkrije vnetno ozadje bolezni. Likvor pri bolniku z MS je bister, brezbarven in izteka pod normalnim tlakom. Koncentracija beljakovin je običajno normalna, pri polovici bolnikov ugotavljamo blago zvišano koncentracijo mononuklearnih celic, le izjemoma več 50·10^6/L. Po barvanju sedimenta likvorja enostavno razlikujemo med limfociti, monociti, opazimo lahko tudi posebne limfocite – plazmatke, ki tvorijo protitelesa (imunoglobuline) (slika 1). Zvišana koncentracija imunoglobulinov v likvorju, predvsem IgG razreda, je pri MS posledica lokalne tvorbe (intratekalne sinteze) teh beljakovin, ki jo ugotavljamo pri 60-80 % bolnikov. Koncentracija IgG v likvorju lahko poraste tudi zaradi povečanega prehajanja (difuzije) iz krvnega obtoka pri okrnjeni funkciji krvno-likvorske pregrade. Lokalno sintezo IgG zato vedno ovrednotimo s pomočjo razmerij (količnik IgG = koncentracija IgG v likvorju/koncentracija IgG v serumu) oziroma indeksov (količnik IgG/količnik albumina).

 
Slika 1: Pregled sedimenta likvorja v Laboratoriju za likvorsko diagnostiko in značilne mononuklearne celice (Li-limfocit, Mo-monocit, Pl-plazmatka).
Najpogostejša sprememba v likvorju bolnikov z MS je prisotnost oligoklonalnih trakov (OT). Preiskava velja kot »zlati standard« za detekcijo lokalne sinteze IgG, saj značilne trakove v likvorju opazimo pri 85-95% bolnikov z MS. Za tolmačenje rezultatov je izredno pomembno, da vzporedno analiziramo sočasno odvzet vzorec seruma, saj lahko le tako ugotovimo prisotnost trakov v likvorju, ki jih ni opaziti v serumu (lokalna sinteza). Trakovi predstavljajo presežek protiteles IgG, ki jih tvori le nekaj klonov plazmatk in jih vidimo, ko s postopkom izoelektričnega fokusiranja na agaroznem gelu ločimo beljakovine seruma in likvorja glede na njihov celokupni naboj (izoelektrično točko). Zaradi različnega celokupnega naboja se namreč različne beljakovine razporedijo v različnih področjih gela s pH gradientom. Po prenosu na membrano specifično »obarvamo« le imunoglobuline IgG, s pomočjo protiteles, ki prepoznajo zaporedja človeških IgG v konstantnem delu molekule (slika 2).
Raziskave kažejo, da se vzorec trakov med potekom bolezni ne spreminja ali pa se sčasoma pojavijo dodatni trakovi. Kljub temu še zmeraj niso poznani vsi antigeni, proti katerim so usmerjena protitelesa IgG pri MS.

Slika 2: Določanje oligoklonalnih trakov v Laboratoriju za likvorsko diagnostiko, KO za bolezni živčevja.

Že od leta 1994 velja v evropskem prostoru soglasje pri podajanju rezultatov določanja OT, razvrstili naj bi jih v enega od petih različnih tipov (slika 3):

1. Tip 1: V serumu in likvorju ni prisotnih oligoklonalnih trakov (negativen izvid).
2. Tip 2: V likvorju so prisotni oligoklonalni trakovi, kar kaže na lokalno sintezo IgG
3. Tip 3: Oligoklonalni trakovi so prisotni v likvorju in v serumu, vendar so v likvorju številčnejši. Izvid je tipičen za sistemsko vnetje z lokalno sintezo IgG.
4. Tip 4: Identični (simetrični) oligoklonalni trakovi v likvorju in serumu kažejo na sistemsko vnetje (upočasnjen pretok likvorja).
5. Tip 5: Monoklonski zobec – monoklonski (izvirajo iz enega klona plazmatk) trakovi v likvorju in serumu kažejo na novotvorbo plazmatk. 

Slika 3: Različni vzorci (tipi) oligoklonalnih trakov pri vzporedni analizi vzorcev seruma (S) in likvorja (L).
O lokalni sintezi IgG govorimo v primeru tipa 2 in tipa 3, ki ju tudi najpogosteje najdemo pri bolnikih z MS. Ne glede na to pa prisotnost OT ni specifična za MS, saj jih vidimo tudi pri drugih vnetnih boleznih živčevja, na primer nevroboreliozi ali paraneoplastičnih nevroloških sindromih.

Novosti v likvorski diagnostiki MS

Določanje OT v likvorju je zahteven, zamuden in drag postopek, interpretacija rezultatov je včasih nejasna in odvisna od izkušenosti laboratorijskih strokovnjakov. Zaradi tega si želimo enostavnejše diagnostične metode z nedvoumnimi rezultati. Raziskave so pokazale, da je določanje prostih lahkih verig kapa (PLVK) v likvorju nekoliko občutljivejše kot določanje OT, vendar tudi nekoliko manj specifično. Lahke verige so osnovni gradniki imunoglobulinskih molekul, ki jih plazmatke tvorijo v presežku nad težkimi verigami. Iz plazmatk se sproščajo skupaj s sestavljenimi molekulami imunoglobulinov. Določanje koncentracije PLVK je hitro in enostavno, podobno kot pri določanju IgG v likvorju pa moramo tudi v tem primeru oceniti lokalno sintezo s pomočjo razmerij oziroma indeksov. Glede na boljšo občutljivost bi preiskava lahko dobila mesto v stopenjski diagnostiki vnetja v osrednjem živčevju ali vsaj dopolnila določanje OT, kadar so rezultati te preiskave nejasni.
V obdobju številnih terapevtskih možnostih bi z analizo likvorja želeli pridobiti tudi čim več prognostičnih informacij pri posamezniku z MS. Morebitni biološki označevalci, ki bi napovedovali potek bolezni, bi pomembno vplivali na odločitve o zdravljenju pri posameznem bolniku. Trenutno so najbolj obetaven kazalec v likvorju lahki nevrofilamenti (NFL), ki so proteini citoskeleta živčne celice (nevrona), pomembni za rast in vzdrževanje strukturne stabilnosti aksonov (živčnih vlaken). Pri propadu aksonov v okviru različnih bolezni, vnetja, travmatskih poškodb ali kapi se sprostijo v zunajcelično tekočino, od koder prehajajo v likvor. Zvišana koncentracija NFL v likvorju nakazuje neugoden zgoden potek pri MS z zagoni ali pojavljanje novih lezij na MR glave. Klinični potencial izkazujejo še nekateri označevalci vnetja, brazgotinjenja (astroglioze) in regeneracije celic, ki bi lahko služili za napovedovanje neugodnega poteka bolezni v različnih fazah MS. Nobenega od omenjenih, vključno z NFL,  trenutno še ne uporabljamo v klinični praksi.

KO za bolezni živčevja uporablja uveljavljene in nove preiskovalne metode

Lumbalna punkcija s pregledom likvorja je uveljavljena preiskovalna metoda, ki jo uporabljamo v diagnostiki različnih bolezni osrednjega živčevja. Približno 90 %  naših bolnikov z MS ima pozitivne OT v likvorju, kar nam olajša postavitev diagnoze. Nove preiskave likvorja so že in bodo kmalu v dodatno pomoč v diagnostiki MS ali napovedovanju poteka bolezni.

Andreja Emeršič, mag. farm.,
Laboratorij za likvorsko diagnostiko, KO za bolezni živčevja

Literatura

1.    Stangel M, Fredrikson S, Meinl E, Petzold A, Stüve O, Tumani H. The utility of cerebrospinal fluid analysis in patients with multiple sclerosis. Nat Rev Neurol. 2013;9(5):267-276.
2.    Huss AM, Halbgebauer S, Öckl P, et al. Importance of cerebrospinal fluid analysis in the era of McDonald 2010 criteria: a German-Austrian retrospective multicenter study in patients with a clinically isolated syndrome. J Neurol. 2016;263(12):2499-2504.
3.    Andersson M, Alvarez-Cermeño J, Cogato I, et al. Cerebrospinal fluid in the diagnosis of multiple sclerosis: a consensus report. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 1994;57:897-902.
4.    Deisenhammer, F. et al. Guidelines on routine cerebrospinal fluid analysis. Report from an EFNS task force. European Journal of Neurology 13, 913–922 (2006).
5.    Emersic A, Anadolli V, Krsnik M, Rot U. Intrathecal immunoglobulin synthesis: The potential value of an adjunct test. Clin Chim Acta. 2019;489.
6.    Thompson AJ, Banwell BL, Barkhof Fet al. Diagnosis of multiple sclerosis: 2017 revisions of the McDonald criteria. Lancet Neurol. 2017;17(2):162-173.  
7.    Rot U. Oligoklonalni trakovi ali proste lahke verige v diagnostiki multiple skleroze? Med Razgl.2016;55 Supp 5:11-115.
8.    Khalil M, Teunissen CE, Otto M, et al. Neurofilaments as biomarkers in neurological disorders. Nat Rev Neurol. 2018;14(10):577-589.